Microscopia Confocale Per Lo Studio Tridimensionale Di Strutture Biologiche

La Microscopia Confocale è una tecnica ottica utilizzata, principalmente, per lo studio tridimensionale di strutture biologiche.

Ma prima di andare nello specifico, mi presento! Il mio nome è Luca e ho avuto l’onore di poter disporre di un link sul sito di Annarita. Quando me lo ha comunicato, mi ha offerto addirittura uno spazio sul suo sito per poter scrivere qualche mio vaneggiamento. Praticamente l’equivalente dei regali di Natale per un bambino!

Tornato sulla Terra, ho pensato di cominciare a parlarvi di uno degli argomenti che più mi appassionano: vedere quel mondo che non riusciamo a percepire con i nostri occhi.  

Sapete quanto è piccola la cosa più piccola che riusciamo a vedere? Prendete un metro dalla cassetta degli attrezzi, dividetelo in diecimila parti e prendetene una sola: la sua grandezza è il limite per il nostro occhio. Se non ci credete, guardate questa immagine.

Carta di Campbell-Robson per la sensibilità al contrasto

                              
Fino a che punto riuscite a percepire l’alternanza bianco-nero, prima che diventi tutto grigio?

Quel pezzetto di metro che ancora riusciamo a distinguere, potrebbe sembrare un limite accettabile, ma il mondo non finisce certo qui, anzi. Fermandoci, non potremmo dar sfogo alla nostra curiosità e scoprire uno spettacolo che non possiamo perderci.  Se il nostro occhio non ce la fa, armiamoci di uno migliore e cominciamo a scoprirlo. Il primo che vediamo è un microscopio confocale. Ne avremo bisogno di tanti diversi, in realtà, perché ogni passo in più che faremo verso il molto piccolo, sarà una porta avente la sua chiave particolare per essere aperta.

Noi vogliamo spingere il grigio indistinto “più in là”, e semplicemente concentrarci e arricciare gli occhi  non è l’unica soluzione. I nostri occhi funzionano come “trappole” per  i raggi di luce, che dal Sole o dalle lampadine raggiungono il mondo circostante. Questi raggi ci inondano, e, come onde del mare su una scogliera, “vanno a sbattere” su tutte le cose. Anche su di noi, e, quando “sbattono direttamente” sui nostri occhi, significa che stiamo guardando la nostra sorgente di luce (magari con il Sole evitiamo di farlo). Gli oggetti intorno, invece, potete pensarli come dei buttafuori davanti ad una discoteca: qualche colore lo fanno passare mentre altri vengono rifiutati e riflessi.  Dal momento in cui la luce entra nel mondo intorno a noi, questo diventa un enorme flipper di raggi di luce che rimbalzano da una parte all’altra, tutti contemporaneamente.

È quando ci raggiungono che noi vediamo: il colore di un oggetto ci sta dicendo che tipo di buttafuori c’è (quando c’è). Se l’oggetto è verde il buttafuori rifiuta il verde, se è rosso significa che ricaccia il rosso. Chiaramente il discorso è un po' più complesso di così, ma i nostri occhi riescono a vedere sfruttando proprio i diversi meccanismi di riflessione ed assorbimento della luce da parte degli oggetti.  

Se vogliamo dividere il pezzetto di metro che ci è rimasto, possiamo distinguere anche una parte mille volte più piccola con un po' di furbizia. Per farlo, basta scegliere che cosa vogliamo vedere e “addobbarlo come fosse Natale”.  

Il problema dei nostri occhi è che sono passivamente bombardati dalla luce. Non possiamo decidere di vedere l’armadio di fronte a noi, mentre la mensola immediatamente a destra no. Percepiamo ciò che sta nel nostro campo visuale. Abbiamo solo una possibilità per non vedere: spegnere la luce. In questo caso non ci sono raggi che ci raggiungono, e noi diventiamo ciechi.

Studio artistico di Beo Beyond, Barcelona, Spain

È  con il buio che possiamo giocarci le nostre carte. Ci sono cose che hanno una fantastica proprietà che fa al caso nostro: la fluorescenza. Se normalmente qualcosa è luminoso solo quando è illuminato, ci sono situazioni in cui i raggi di luce vengono assorbiti e poi riemessi. Queste cose sono in realtà molecole.  È  come se, per un attimo, gli oggetti fluorescenti diventassero delle lampadine. E non è finita qui, perché due oggetti fluorescenti diversi possono rilasciare una luce di colore diverso. 

L’immagine precedente è un esempio molto artistico: tutto ciò che è luminoso, è raggiunto dalla luce della stessa lampadina bluastra, ma ciascun oggetto emette un colore diverso. Questi pigmenti “colorati” sono chiamati fluorofori: ciascuno di essi assorbe un colore e ne riemette un altro, anche se solo per un attimo (bisognerebbe precisare che assorbono una radiazione ad una data lunghezza d’onda e riemettono ad una lunghezza d’onda maggiore).
Appena la luce si spegne, anch'essi si spengono: non proprio immediatamente, ma il ritardo è così breve che non riusciamo ad accorgercene. Se ci pensate, questa fluorescenza è una gran cosa. Ricordatevi di non confonderla con la fosforescenza però!

Vediamo come usarla. Pensiamo di avere a disposizione questi fluorofori piccolissimi, molto più piccoli del nostro pezzetto di metro. Se illuminassimo gli oggetti con la luce della nostra stanza, sapete cosa vedremmo? Praticamente nulla…è vero che i nostri fluorofori sono molecole, ma noi non riusciamo a distinguere qualcosa che sia più piccolo del nostro pezzetto di metro. Quello che accade è che le emissioni dei fluorofori si sovrappongono in uno stesso punto della nostro visuale e addio dettagli.

Proprio per questo vi ho detto che dobbiamo essere furbi; non possiamo guardarle tutte insieme: sappiamo che le nostre luci ci sono e aspettano solo di poter essere eccitate, ma noi dobbiamo farlo evitando sovrapposizioni (per quanto possibile). Prendiamo una sorgente di luce piccolissima e puntiamola solo su un punto: quello che vedremmo proviene esattamente da lì. Se ci sono dei fluorofori, avremo qualcosa da rilevare, altrimenti sarà il buio.

Analizzato un punto, ci spostiamo al successivo e ripetiamo l’operazione per tutta l’estensione di ciò che vogliamo vedere. Alla fine, un computer ci saprà restituire l’immagine finita con la collezione di tutti i punti. Dobbiamo essere molto precisi, ma usando un laser possiamo avere dei risultati notevoli ed una minuzia impensabile per i nostri occhi. 

Tetrahymena thermophila

La vedete la linea bianca orizzontale nella figura? La possiamo usare come riferimento per il confronto perché la sua lunghezza è pari a 0,000016 metri, mentre noi riusciamo a distinguere i pallini verdi molto più piccoli.

A questo punto, ci sarebbero da muovere un paio di obiezioni. Me le muovo da solo.

La principale riguarda il modo in cui vengono sistemati questi fluorofori su ciò che vogliamo osservare. Finora ho solo affermato che ci sono, ma anche il loro posizionamento è un fattore cui dobbiamo stare attenti.
Poniamo che il vostro obiettivo sia una cellula. Per quanto non conosciate in particolare quella che volete studiare, avete comunque una idea della sua composizione. Sapete, in particolare, che le sue parti possono legarsi con differenti molecole: potete ricavare queste informazioni dai biologi e dai chimici,che saranno ben lieti di aiutarvi.

Scegliete una molecola che si lega selettivamente ad un componente della cellula, preparatela - aggiungendoci un fluoroforo-, e datela in pasto alla vostra “modella”. Durante la scansione, saprete che, se vedete quel colore, e quindi quel fluoroforo, lì ci sarà il componente interessato alla nostra molecola speciale. Da qui si capisce che, se siamo abbastanza furbi, possiamo usare fluorofori di colori differenti  per componenti diversi. Praticamente  “coloriamo” la nostra cellula. 

Fluorescenza

La seconda obiezione che mi muovo è una domanda: “Se il fascio laser avesse un estensione più piccola del nostro fluoroforo, allora non ci sarebbero problemi, ma -se fosse più grande- siamo sicuri che non beccheremmo anche qualche altro fluoroforo da qualche altra parte?  Magari più a destra, più a sinistra oppure più indietro?” Ecco messo a nudo il limite della tecnica! I poveri fluorofori si vedono raggiunti da un fascio che per loro è enorme, chissà quanti se ne accendono nel momento in cui noi crediamo di vedere un punto.  È come se pensassimo di puntare una casa ed, invece, stiamo interessando tutta l’Italia. 

Per questo possiamo cercare solo di limitare i danni: tanto più siamo bravi a farlo più è alta la nostra risoluzione. Facciamo un buchino su un filtro opaco che poniamo davanti al nostro sensore; se stiamo attenti al corretto posizionamento di ciò che stiamo guardando (del filtro e dello stesso sensore), possiamo considerare che la zona da registrare è la più piccola possibile.
Per fare questi calcoli in maniera precisa ci vuole un po' di ottica, ma in sostanza cerchiamo di bloccare tutto ciò che non si trova sul punto che stiamo guardando: da questo dipende la nitidezza delle nostre immagini.

Se vogliamo osservare qualcosa di più piccolo, dovremo vedere che cosa altro si sono inventati! Per il momento  vi lascio con la parte centrale della coclea di un mammifero: quelli rossi in basso sono i neuroni, che comunicano al cervello i suoni captati dai recettori (in verde). Ditemi se non è stupendo.

I crediti della foto appartengono alla Dr. Sonja Pyott, Department of Biology and Marine Biology, University of North Carolina, Wilmington, NC, USA. Quarta classificata alla Olympus BioScapes International Digital Imaging Competition del 2007.